大家好今天喆圖小編給大家?guī)淼氖鞘褂?strong>恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋做細胞凍存和復(fù)蘇實驗。

實驗方法原理

        細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。

實驗材料 細胞 
儀器、耗材 微量加樣槍、吸頭、離心管、凍存管、槍頭膠、塞移液管、玻璃瓶、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮、膏移液槍、超凈工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱、倒置相差顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、液氮冰箱、

1. 儀器：凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴鍋、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

5. 試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

3. 離心1 000 rpm，5 min。

5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。

7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入水浴鍋37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

3. 離心， 1 000 rpm，5 min。

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。收起

 2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。

其他

二、慢凍程序

2. 簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。

 三、低溫保護劑的應(yīng)用 在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

1. 預(yù)先配制凍存液 （1）10%DMSO + 細胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液） （2）10%甘油+ 細胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

3. 加入1 ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。

1. 快速解凍 凍存細胞從液氮中取出后，立即放入3中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。

3. 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感 解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

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